Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas pebedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Analisis dengan kromatografi dapat digunakan untuk analisis kualitatif & kuantitatif.
Jenis kromatografi umumnya ada 2 yaitu kromatografi planar dan kromatografi kolom.
Kromatografi Planar
Kromatografi kertas dan kromatografi lempeng tipis. Disebut planar karena teknik analisisnya menggunakan fase diam berupa lempengan yang datar.
Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam :
a. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.
b. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.
Berdasarkan mekanisme pemisahannya kromatografi terdiri atas :
a. Kromatografi Adsorbsi
Teknik analisis yang didasarkan pada adsorpsi (penyerapan). Adsorpsi ialah gejala timbulnya konsentrasi zat yang lebih besar pada bidang perbatasan antara dua fasa daripada dalam masing-masing fasa. Terjadinya pemisahan ialah akibat gaya tarik fasa stasioner (fasa diam) yang kuat terhadap komponen– komponen yang harus dipisahkan. Gaya tarik yang kuat ini disebabkan oleh interaksi kimiawi dan atau interaksi Van Der Walls.
b. Kromatografi Partisi
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai fasa diam dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Teknik pemisahan pada kromatografi partisi sangat mirip dengan kromatografi absorpsi, perbedaannya terletak pada sifat dari fase diam. Dimana fase diamnya adalah lapisan zat cair yang disangga oleh zat padat. Pada keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian fasa gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC). Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam.
c. Kromatografi Pasangan Ion (IPC)
Teknik analisis untuk memisahkan campuran kompleks yang terdiri dari molekul ionic dan polar. Didasarkan pada pembentukan suatu pasangan ion antara sample dan fase bergerak maupun fase diamnya. IPC disebut juga kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan suatu cairan penukar ion dan paired ion chromatography (PIC). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama. IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase balik. Fase diam dari rase balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak silika yang disilanisasi (misalnya C8 atau C18 Bonded Phase) atau dari suatu pengepak yang diperoleh secara mekanik, fase organik yang tidak dapat bercampur dengan air seperti 1 pentanol. Fase diam yang dipakai adalah Cs atau CIS BPC Packing. Fase gerak terdiri dari suatu larutan bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti metanol atau asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding,yang muatannya berlawanan dengan molekul sampel.
d. Kromatografi Penukar Ion (IEC)
Teknik analisis yang mampu memisahkan solut anionik dan kationik dalam campuran. Terjadi proses bolak balik di mana terjadi pertukaran ion antara fase cair dan fase padat (penukar ion) Prinsip pemisahan adalah pertukaran ion-ion yang dibawa oleh fase gerak dengan ion pada fase diam. Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion.
e. Kromatografi Ekslusi Ukuran
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan. Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel. Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex, suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT. Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.
f. Kromatografi Afinitas
adalah teknik dalam kimia analisis yang digunakan untuk memisahkan dan mengikat molekul biologi dari campuran, didasarkan pada aktifitas dari molekul yang diinginkan pada ligan pemisah, yang biasanya terdapat pada susbstansi padat dan inert. Dasarnya ialah seperti ikatan antara gembok dan kunci. Pada kromatografi ini, digunakan fase diam yang mempunyai gugus tertentu yang reaktif terhadap suatu senyawa yang akan dipisahkan. Biasanya campuran biokimia yang dipisahkan berdasarkan pada interaksi biologis yang sangat spesifik seperti antara antigen dan antibodi, enzim dan substrat atau reseptor dan ligan. Pada prinsipnya pemurnian kromatografi afinitas merupakan pemurnian satu tahap yang merupakan pengikatan spesifik ligan dengan reseptor.
Berdasarkan alat yang dipakai, kromatografi terdiri atas :
a. Kromatografi Kertas
Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut. Kromatogarfi kertas hampir sama dengan kromatogarfi lapis tipis, perbedaannya fase diam dari kromatografi ini hanya berupa kertas.
b. Kromatografi Gas
Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi antara solute dengan fase diam. Fase diam berupa gas akan mengelusi solute dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke detector. Penggunaan suhu yang meningkat (biasanya pada kisaran 50-350°C) bertujuan untuk menjamin bahwo solute akan menguap dan karenanya akan cepat terelusi. Ada 2 jenis kromatografi gas :
1. Kromatografi gas-cair (KGC)
Pada KGC ini, fase diam yang digunakan adalah cairan yangdiikatkan pada suatu pendukung sehingga solute akan terlarutdalam fase diam. Mekanisme sorpsi-nya adalah partisi.
2. Kromatografi gas-padat (KGP)
Pada KGP ini, digunakan fase diam padatan (kadang-kadangpolimerik). Mekanisme sorpsi-nya adalah adsorpsi.
c. Kromatografi Lapis tipis
Pemisahan komponen kimia berdasarkan prinsip adsorbsi dan partisi, yang ditentukan oleh fase diam (adsorben) dan fase gerak (eluen), komponen kimia bergerak naik mengikuti fase gerak karena daya serap adsorben terhadap komponen-komponen kimia tidak sama sehingga komponen kimia dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda berdasarkan tingkat kepolarannya, hal inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan. Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi adsorpsi dan adsorben (silika gel (asam silikat), alumina (aluminium oxide), kieselguhr (diatomeous earth), dan selulosa) bertindak sebagai fase stasioner. Dalam kromatografi lapis tipis, bahan penyalut yang digunakan beraneka macam. Silika gel yang paling banyak dipakai.
d. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Merupakan teknik pemisahan analit-analit berdasarkan kepolaran. Fase geraknya berupa cairan sedangkan fase diamnya berupa cairan atau padat. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan dapat ditingkatkan dengan besar.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar